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专家采访

试剂盒验证工作不可小瞧 做好了可以拿下博士学位

【2019-02-22】
       STR检测已经成为法医领域的常规工作,市场中各种STR检测试剂盒也不断涌现。为了保证试剂盒能在各种条件下表现出稳定的性能,试剂盒验证就成为了一项必不可少的工作。
       对于试剂盒生产厂家来说,验证工作确认了试剂盒能够满足设计的性能,确保了试剂盒的可靠性;对于终端用户来说,验证工作确认了试剂盒能在自己的实验室内稳定工作,确保了日常工作的顺利进行。
       今天,大阅哥就和大家来聊一聊试剂盒验证那些事。



       我们或多或少可能都会接触一些试剂盒验证的项目及任务。可不要小瞧验证实验,如果严格地对一款试剂盒做好各项验证实验,其数据是可以发表在法医学顶级期刊的!比如阅微基因的Microreader™ 23sp ID System 试剂盒,验证实验由华西医学院侯一平老师独立进行,验证结果发表于法医学顶级期刊FSI:Genetics (图1)。验证工作的重要性可窥一斑。


图1 阅微基因Microreader™ 23sp ID System 试剂盒验证

       由于试剂盒验证的重要性,国内外都有权威文件对验证工作做出了指导。在国内,我们参考的标准主要是《GA/T 815-2009 法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》,相信广大的法医DNA工作者对此应该也是较为熟悉的;而在国际上,我们参考的主要是来自SWGDAM工作组的《SWGDAM Validation Guidelines for Forensic DNA Analysis Methods》。结合两份权威文件,形形色色的验证实验项目总计多达十余项。例如PCR方法学研究、灵敏度、特异性、准确性、混合物、抗抑制能力、影子峰比例、背景噪音、不同检材适应性研究等等。

       大阅哥挑选了影子峰、背景噪音和反应体系三个验证项目进行介绍。


1. 影子峰比例研究


       如何规定影子峰的阈值呢?是主峰的15%还是20%?
       在实际工作中,我们可能会根据经验,对影子峰的界定使用一个统一的阈值;但实际上,不同基因座的影子峰情况是不同的。
       还是以阅微基因23sp的验证为例。如下表所示,对于23sp试剂盒的不同基因座,其平均影子峰比例差异很大。影子峰最低的基因座,其平均影子峰比例仅为主峰的3-4%;而影子峰最高的基因座,其平均影子峰比例为主峰的11-12%。


23sp试剂盒的影子峰比例研究

       本研究共观察了200份样本的影子峰。表中各列从前到后分别为:基因座名称、观察到的最低影子峰占主峰的比例、观察到的最高影子峰占主峰的比例、平均影子峰比例、影子峰比例的标准差、以及根据此研究推荐的影子峰比例阈值。其中,影子峰比例推荐阈值的计算方法为:影子峰比例平均值+3倍的标准差。
       所以,在实际工作中,我们不能用统一的标准来判定不同基因座的影子峰。尤其是案件试剂盒,鉴于现场样本常存在混合样本和外源DNA污染,对影子峰的判定和排除更为关键。作为试剂盒的生产者,我们需要告诉用户阅微基因试剂盒不同基因座的影子峰表现情况,便于用户使用。

2. 阴性对照

       大家可能会有点奇怪:我们平时也会设置阴性样本呀,这有什么特殊的?
       事实上,平常我们进行阴性对照实验,是为了看有没有非特异性杂峰出现,主要目的是防污染。而此处我们提及的阴性对照实验,是为了研究该试剂盒检测时的背景噪音情况,给出更准确的检测峰高阈值。
       在日常工作中,GeneMapper IDX软件设置的检测阈值有一定的范围,不同的检测仪器(如3730或3500)、不同的检测试剂盒都可能影响到检测结果中的背景噪音。
       背景噪音影响真的很大吗?
       对于案件试剂盒,背景噪音的强度真的很关键!因为在案件中我们经常会碰到微量检材,特别是近些年出现了越来越多的接触性检材。这类检材所能提供的DNA非常少,导致目标峰的信号强度可能很弱。此时如果背景噪音太强,就很可能掩盖住真正的信号峰。
       大阅哥在进行内部验证的灵敏度研究时发现,如果以200RFU为阈值,在样本加入量为31pg时,不少基因座会出现丢峰的现象;而如果把阈值调低至100RFU,绝大部分信号峰就可以辨认了。因此,尤其是对于案件试剂盒,生产者应该提供该试剂盒在特定检测仪器上基线噪音的表现情况,以便于用户分析微量检材的分型结果。

3. 反应体系

       反应体系属于PCR方法学研究,常见的还有改变PCR反应组分的起始浓度,或是改变PCR流程中不同步骤的温度等,由此获得了不同的分型图谱。那么,我们如何通过理解图谱中的信息来确定最优的PCR条件呢?这边便要说到结果的分析和展示方法。
       让我们来看一组结果。这组实验的目的是研究PCR体系的体积是否会影响试剂盒性能。为什么要进行这项研究呢?因为在建库中我们往往会采用10微升体系,而不是常规的25微升。经验告诉我们,这样并不会影响建库的结果。那我们就要实际地测试一下,反应体积到底对试剂盒的分型结果有什么影响。
       先来看两份分型图,分别是5微升及10微升PCR体系的结果,见图2。所有的信号峰都检出了,而且峰高都很高,那此时该如何评价分型效果呢?


图2 不同PCR反应体积的分型结果
A.5微升反应体系   B.10微升反应体系

       此时我们可以计算不同实验条件下分型结果的峰高均衡性来体现不同条件下的分型效果。这里大阅哥展示的是一款Y试剂盒的结果,我们计算的是染料组内均衡性(即某一染料组中最低峰的峰高除以最高峰的峰高的百分比)。


图3 反应体系染料组内均衡性测试结果
X轴代表峰高均衡性,Y轴代表各染料组不同的反应体积

       均衡性计算结果如图3所示。其中每一种颜色代表相应的染料组,每一体积进行了三次平行实验,其组内均衡性计算结果用一个圆点表示。图中红色三角形代表了三次平行实验组内均衡性的平均值。可以看出,随着反应体系体积的减小,分型结果的组内均衡性有降低的趋势。其中,25微升体系和10微升体系的组内均衡性相差较少。
       结合对分型图的观察,我们可以说:在这个实验中,选择较小的反应体积虽不会影响信号峰的检出,但确实影响到了峰高,而不同基因座所受影响程度不同,因此使得总体的均衡性下降。对于建库来说,由于很少出现污染的混合样本,且样本量足,检测的信号峰高度很高,因此减小PCR体积影响不大,可以选取10微升体系;但是对于案件样本,其对于均衡性的要求高,此时就不适宜减小PCR体积,而是应该严格遵循说明书采用25微升体系。
       如果各位觉得上面的分析图看起来还不错,大阅哥在这里也推荐一个分析软件:

R语言包“strvalidator”

       strvalidator提供了数据过滤、检出率分析、检测限分析、均衡性分析、ladder精确度分析等一系列功能,可以有效地提高您的工作效率。当然,作为R语言的一个函数包,它也是完全开源、免费的。
       值得一提的是strvalidator采用的均衡性计算方法比较特殊:它是将一个染料组内的峰高之和记为100%,然后计算各个基因座的峰高的占比(图4)。


图4 使用strvalidator软件包直接计算的均衡性结果

       如图4所示,该结果给出了全部基因座的峰高占比的箱图,可以用于试剂盒优化。这里的“均衡性”计算方法为将某一样本中某一染料组的峰高之和定义为100%,计算该染料组内各个基因座的峰高的占比,可以直观地展现某一染料组内各个基因座的峰高对比。
       这种均衡性算法对于试剂盒开发较有帮助,但可能不符合我们验证实验中的使用目的。为此,大阅哥在strvalidator的基础上开发了自己的分析代码,绘制了如图3的分析结果。
       如果大家对试剂盒验证工作感兴趣,想要了解更多,欢迎和我们联系。此外,大阅哥自己的代码虽说可以满足研究用途,却还远称不上成熟。如果哪位看官对R包开发有经验,并对STR数据分析有兴趣,也欢迎与我们联系一同开发简单易用的STR分析工具。

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参考文献:

Hansson, O., et al. (2014). STR-validator: an open source platform for validation and process control. Forensic Science International: Genetics. DOI: 10.1016/j.fsigen.2014.07.009

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