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法医DNA小课堂—— 如何判读Off Ladder?

【2018-10-15】
STR分型是法医领域最常用的个体识别方法之一。凭借GeneMapper的强大功能,我们可以大批量、自动化地解决大部分STR基因座的分型问题。

然而,我们会在少部分样本中观察到无法自动标注的Off-Ladder(OL)。有些时候OL是由于分析软件的误差/错误引起的;还有可能是我们遇到了罕见的基因分型。

我们应该如何处理不同情况中出现的OL问题?

今天,大阅哥给大家分析几种可能出现的OL,希望能帮助小伙伴们对OL有更好的理解,在工作中更顺利地解决它所带来的问题。

01  分析方法引起的误差



GeneMapper IDX中的Size Calling Method选项,大家一般不大关注,往往选取默认方法:Local Southern Method。实际上,不同的分析方法是会造成结果差异的。具体的说,就是软件判读的信号峰大小会有差异。下面是大阅哥做的两个小实验:
 
任意选取了一份样本,挑选了四个基因座,分别使用默认方法Local Southern和3rd-Order Least Squares来进行分析,结果见表1:

表1 使用两种分析方法,结果中分型大小的差异



可以看到,在基因座较小的情况下,两种分析方法之间的差异还比较小的;然而到了200~300bp的范围,两种分析方法的差异可达0.5bp以上。

幸运的是,在这一份样本中,两种分析方法都给出了正确的分型,并没有造成OL的出现。但情况不总是如此,请看下面另外一份样本结果:


图1 使用Local Southern进行分析

图2 使用3rd-Order Least Squares进行分析

在这份样本中,默认方法误判的OL可以被另一种分析方法正确识别

尤其是当我们发现小片段的STR经常出现误判的OL时,我们可以考虑更改分析方法。这是由于当下各家厂商生产的试剂盒中,包含的STR基因座越来越多,使得小片段STR越来越“小”,逼近了内标中的最小边界。

由于Local Southern的原理限制,使得小片段的大小分析可能有误。因此,在ABI的GeneMapper IDX说明中写道:“在使用该公司的MiniSTR试剂盒时,不应使用Local Southern方法。”

图3 GeneMapper IDX说明书的提示

当然,这里要提醒大家,实验和分析的很多步骤都会影响最终的结果,分析方法本身只是影响因素之一。不同的分析方法很可能获得相同的分型结果;改变分析方法也不保证能解决小片段出现OL的问题。具体什么时候应该改变这项设置,有兴趣的朋友可以在自己的工作中进行一些尝试和验证。

02  罕见等位基因引起的OL


如果罕见等位基因OL是出现在基因座的Ladder范围之内,其分型是相对好判断的,只需要根据其左右两侧的Ladder的分型来计算即可。这里,我们要介绍的是两种较为特殊的情况:

1. OL在Ladder的范围以外

厂商给定的Ladder无法涵盖整个基因座的范围。

如果出现了极小或极大的OL,超出了Ladder的范围,我们是否可以依据它和离它最近的Ladder之间的距离来计算其分型呢?

恐怕并不一定准确,甚至可能是错误的

据以色列DNA数据库实验室2012年报道,在对一份样本使用SGM Plus Kit进行检测时出现了一个大的OL等位基因,位于D3S1358区域[1]。通过和附近ladder的对比,认为是等位基因22.2。复核检验使用多种试剂盒,得出了截然不同的多种结论。例如,用PowerPlex ESX17 Kit检测,该信号峰位于TH01基因座范围内;而在NGM Kit中,该信号峰则被标记为D1S1656 等位基因9。

最终测序的结果表明,这一未知基因为D3S1358 等位基因22。这一报道提示我们,在超出ladder范围信号的判断中,直接依据相邻ladder的计算是可能出现问题的。这也与我们第一部分的讨论有所联系,即CE平台分型给出的片段大小实际上是个相对值。没有两侧Ladder做标定,我们是无法使用片段大小的数值做绝对定量计算的。

Dr.Butler在其著作中建议:将上述OL标定为>22更为合适,而非通过简单计算认为是22.2[2]。当然,对OL进行测序验证将是最为准确的一种判断方式,但显著地增加了时间和成本。

2. OL在两个基因座之间

这一情况是指:OL出现在两个基因座中间,且不在任意一方的Ladder范围内。选择不同的试剂盒进行检验是个好主意。

在客户的实际案例中,一个稀有的OL基因坐落于D3S1358和D1S1656中间,这一信号峰超出了相邻两基因座的ladder范围。

使用阅微基因MicroreaderTM 23sp ID System 做复核检验,发现这一OL基因属于D1S1656,通过对比计算为等位基因7。进一步的测序也证实了这一判断。

而Dr.Butler在著作中还给出了一些其它的分辨建议:如根据两个基因座的杂合性信息,认为OL属于杂合性高的一方等等[2],但这些方法是无法确认OL的“归属问题”的。

如果其它试剂盒也无法分辨,或产生了矛盾的结果,最终还是需要对OL两侧的两个基因座进行测序,以给出最终的确认。


如果您工作中遇到超出ladder范围的问题,欢迎联系我们的技术支持,拨打OL热线13391963439,我们将协助您验证。此外,阅微基因可以提供基因测序验证服务,助您准确判断疑难OL的真实分型。阅微基因将竭力协助客户对于疑难检材和案件的处理,为客户提供专业技术协助和整体解决方案。

Reference:
1. Raziel A, et al. (2012). Discordance at D3S1358 locus involving SGN PlusTM and the European new generation multiplex kits. Forensic Science International Genetics, 6: 108-112. DOI:10.1016/j.fsigen.2011.03.010
2. (美)JM. Butler著. 法医DNA分型专论:证据解释. 侯一平,李成涛,严江伟主译. 北京: 科学出版社,2018.1. P51~52

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