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ChIP-Seq

ChIP-Seq

染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)是在体内环境中研究蛋白质与DNA 相互作用的经典实验方法,广泛应用于组蛋白修饰、特定转录因子的基因调控作用等相关领域。

简介

       随着新一代测序技术的发展和成熟,染色质免疫沉淀实验与高通量测序的整合,能够高效的在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA 区段,并且可以基于多个样品进行差异分析。ChIP-seq 是精确、敏感、通量高且成本低廉的方法,可实现目标蛋白在全基因组范围内的全部结合位点的定位与测序。


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案例解析

基于ChIP-seq 揭示转录因子ZEB1 转录调控新机制


       上皮- 间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤侵袭和转移的首要步骤。Zeb1 是EMT过程中的关键转录因子之一,它与多种癌症的发生发展有关,但在胶质母细胞瘤(GBM)中Zeb1 具体调节哪些基因还并不清晰。

       本文研究人员对细胞模型进行了基于Zeb1 的ChIP-seq,研究转录因子Zeb1 在全基因组范围的结合情况,发现它在4,430 个基因上有高达6,879 个结合峰,但并非全都产生调控作用。Zeb1 在GBM 中是高表达的,作者使用shRNA 敲低Zeb1,72h 后观察基因的表达变化,发现200 个基因下调,98 个基因上调。紧接着,结合基因表达谱的分析,确认这些基因的变化是否受到Zeb1 的直接调控,结果发现Zeb1 的结合与多个基因的上下调均显著相关。Zeb1 直接抑制的基因(如Myo6, Shroom3, Pard6b,Nrxn3)GO富集到上皮细胞分化等,Zeb1 直接激活的基因(如Itgb1, Nrp2, Prex1 ,S100B)GO 富集到糖蛋白代谢过程等。同时,为了研究Zeb1 的结合特性,作者也对motif进行了分析,发现Zeb1 大量结合E-box 序列(CAGGTG )和HMG-box 序列(ACAAAG )。最终,通过研究证实,Zeb1 可以同时调控胶质母细胞瘤干性基因表达的激活和抑制,而非传统认为的EMT 因子是转录抑制因子。Zeb1 抑制作用的发挥需要结合DNA 上的E-box 序列,而Zeb1 的激活作用是通过间接招募Lef/Tcf 因子来促进基因表达(不激活Wnt 通路)。

Rosmaninho P, et al. “Zeb1 potentiates genome‐wide gene transcription with Lef1 to promote glioblastoma cell invasion” The EMBO journal (2018) DOI 10.15252/embj.201797115(Impact factor: 10.557)


ChIP-seq 结合转录组测序揭示慢性疼痛如何持续发生


       慢性疼痛是引起神经元和小胶质细胞特征改变的一种常见而且具有破坏性的条件,现已发现许多与慢性疼痛发展和维持相关的神经生物学机制,其中异常的小胶质瘤响应在慢性疼痛患者的中枢神经系统中具有突出的作用。目前一个主要的未解决的问题是,为什么在最初的伤害减轻或愈合之后,这种改变会长期持续下去。本文通过研究神经损伤引起的增强子损伤特异性的改变,揭示神经系统免疫细胞的表观遗传对慢性疼痛的影响。对四组脊髓神经结扎(SNL) 和假手术(sham) 后7 天小鼠的脊髓小胶质细胞分别进行转录组测序和H3K4me1 抗体富集ChIP-seq。转录组测序结果显示,已知的小胶质细胞基因,如组织蛋白酶(Ctss)、趋化因子受体(Cx3cr1)等在小胶质细胞中高表达。与sham 组相比,107 基因(约占50%)表达量上调,其中17 个基因在SNL 样本中显著表达上调。将这些上调基因与小胶质细胞上调基因进行GO 富集分析,发现免疫反应相关terms 显著富集,包括干扰素γ、干扰素β 和补体信号传导。
       脊髓小胶质细胞H3K4me1 ChIP-seq 结果显示sham 和SNL 小胶质细胞与皮质小胶质细胞的共有结合图谱在很大程度上重叠。与sham 对照组相比,损伤的小胶质细胞有很多的差异结合的峰,发现了神经损伤后出现的36 个潜在增强子和12 个抑制区域。富集分析结果显示,SNL 上调的H3K4me1 结合区域富集在免疫和炎症反应通路中,例如由趋化因子和细胞因子介导的淋巴细胞和白细胞增殖与炎症等。大脑中绝大多数蛋白质的半衰期都少于14 天,因此很难从蛋白的角度长远地看出蛋白异常功能应如何维持。
       本文从表观水平和转录水平进行验证,发现许多潜在增强子区域在神经损伤发生的28 天仍然存在,而这个时间点大多数转录本变化已恢复正常,表明神经损伤造成的持久性的后果可能隐藏在表观基因组中。


Denk F, et al. “Persistent alterations in microglial enhancers in a model of chronic pain”. Cell reports (2016)DOI:10.1016/j.celrep.2016.04.063(Impact factor: 8.032)


研究趋势

       ChIP-seq 主要用于研究蛋白质与核酸之间的相互作用,后可根据蛋白质的生物学功能对基因组进行注释或者探寻调控机制。目前ChIP-seq 常与转录组学结合起来解决表观修饰生物学问题的所在,例如转录因子的生物学功能等。

常见问题

1. 哪些物种可以做ChIP-seq ?
物种为2 倍体,基因拼接至染色体水平(NCBI),注释完整(GTF 文件)即可。
2. 阳性对照和阴性对照是什么?
阳性对照:一般用anti-RNA polymerase II 抗体,因为RNA polymerase II 是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基
因的核心启动子区,因此理论上,ChIP 后PCR 会有条带。一般阳性对照不进行测序。

阴性对照:阴性对照分为mock 和input 两种,二者均能起到减少假阳性的作用。mock:用普通IgG 为抗体,理论上不会ChIP 下来任何DNA 片段,因此作为阴性对照,但是由于非特异性结合,或者实验过程,没发生结合的DNA 清除不完全,可能会出现条带,但是一般条带亮度较弱。IgG 不需要进行测序,只是判断IP 试验中所选取的抗体是否特异。

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